基金项目:国家自然科学基金项目(51508448)
第一作者:王晓昌(1953-),男,教授,主要研究城市污水再生与资源化.E-mail: xcwang@xauat.edu.cn
(西安建筑科技大学 环境与市政工程学院,陕西 西安 710055)
(School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an Univ. of Arch. &Tech., Xi'an 710055, China)
Chlorella vulgaris; nitrogen(N); phosphorus(P); phosphorus stress; maximum light energy conversion efficiency of PS Ⅱ reaction center (Fv/Fm)
DOI: 10.15986/j.1006-7930.2019.01.002
磷(P)常被认为是水体富营养化的限制因子之一,对藻类生长及光合作用有很大的影响.以普通小球藻(Chlorella vulgaris)为实验对象,测定低磷浓度下小球藻的生物量、营养盐的吸收利用和光合效率的变化情况.结果表明:试验氮磷浓度范围(NO3-N:1~8 mg/L; PO43-P: 0.2~1.0 mg/L),小球藻生物量受初始磷浓度的影响较大,P=0.4 mg/L时小球藻生长最好.在实验磷浓度范围内,初始供磷水平影响小球藻对外源氮的吸收利用,氮(N)的吸收量会随着初始供磷水平的提高而增大.在固定磷浓度条件下,提高氮浓度,小球藻叶绿体中PSⅡ反应中心的最大光合作用效率(Fv/Fm)均值也会随之增加,发生磷胁迫的Fv/Fm阈值为0.18~0.24.Fv/Fm值可综合表征小球藻的生长指标、氮和磷的吸收利用率并且研究营养盐胁迫下藻类的生长.
Phosphorus(P)is usually considered as one of the limiting factors of water eutrophication, and it has has a great influence on growth and photosynthesis of microalgae. During the experiment, Chlorella vulgaris was selected as the research object, the biomass growth, absorption and utilization of nitrogen and phosphorus and photosynthetic efficiency were measured at low phosphorus content. The results revealed that within the scope of NO3-N: 1~8 mg/L and PO43-P: 0.2~1.0 mg/L phosphorus was the main limiting factor to influence the growth of C. vulgaris. The optimal supply of phosphorus content for C. vulgaris growth was 0.4 mg·L-1 .Within the range of experimental phosphorus content, absorption of exogenous nitrogen(N)increased with the increment of initial phosphorus content. When the phosphorus content was determined, the average value of Fv/Fm increased with increment of the nitrogen content, the threshold of Fv/Fm for phosphorus stress of C. vulgaris was 0.18~0.24. Fv/Fm had a significant correlation with biomass, the absorption and utilization of nitrogen and phosphorus, using Fv/Fm can synthetically characterize algae growth status and study on the growth of microalgae under nutrient stress.
微藻常见于湖泊水体环境中,氮和磷是其生长和繁殖的必需营养物质.在多种自然水体中,80.6%的氮元素是以硝态氮的形式存在的[1],磷酸盐磷也被认为是自然水体中植物生长最主要的限制性元素[2].藻类的光合作用是吸收光能通过光化学反应发生电荷分离,将光能转化为电能; 同时分离后的电子与质子以电子传递的方式,使电能转化为化学能,生成ATP与NADPH,从而进行生命活动.磷元素一般以磷酸根的形式存在于植物体内,在生成和消耗ATP的过程中起着能量传递的作用[3],能影响微藻对光能的转换和利用[4],进而影响生长速率和光合作用[5].
过低的磷浓度会阻碍微藻的生长,削弱其光合效率,被吸收的过量光能会转换为热和荧光发射.所以利用叶绿素荧光技术能通过测定反映光合活性的荧光参数,在一定程度上反映微藻受胁迫的程度[6,7].国内外已有一些有关叶绿素荧光法研究营养盐胁迫对微藻光合作用影响的报道.Li等[8]发现光系统PSII是感应磷胁迫最灵敏的复合体,而PSⅡ的最大光能转化效率(Fv/Fm)常用于研究植物的胁迫反应,对环境变化的感应较为灵敏,使用频率最高[9].微藻的Fv/Fm值一般稳定在0.65左右,不同藻类间有一定差异,但在胁迫条件下此参数通常呈下降趋势[10,11].Beardall等[5]研究发现磷缺乏导致二形栅藻在培养后期生长受到限制,光合电子传递能力降低,藻细胞光合作用受抑制.目前来说,国内采用调制叶绿荧光成像系统对于赤潮蓝藻与高等植物的相关研究较为丰富,但对淡水藻种的这一指标研究还比较少 [6].
地表水环境水体中蓝藻、绿藻为优势种类,且小球藻最为常见[12].本研究以普通小球藻(Chlorella vulgaris)作为研究对象,具有生长快、繁殖迅速的特点,是富营养化常见藻种之一.本研究通过测定小球藻的常规生物量指标、对硝氮、正磷酸盐的利用情况以及叶绿素荧光参数的变化,分析了低磷浓度下小球藻生长及光合作用效率变化的相 关性,根据普通小球藻的光合活性快速判断小球藻的是否处于营养缺乏状态以及受胁迫情况.
研究对象选择普通小球藻(Chlorella vulgaris),编号:FACHB-24,购自中科院武汉生物研究所.
实验采用的氮和磷分别以NaNO3和K2HPO4为原料,参考《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)V类水水质,同时参考易文利等[13]的对太湖中优势绿藻的模拟实验,得到藻类的最佳生长磷浓度为P=0.445 mg/L,设置了表1所示的氮磷浓度.除氮和磷之外,其余营养元素均参考BG-11培养液的配方以及生长环境进行设定[14].分别在1000 mL锥形瓶中加入配制的500 mL不同氮磷浓度梯度的培养基,将其于121 ℃灭菌30 min,灭菌完成后置于无菌操作台中冷却至室温,保存待用.
首先用BG-11培养基在恒温生化培养箱(MGC-250P,上海一恒,中国)中将小球藻培养至对数期,使藻密度达到2~3*106 cells·mL-1.然后对小球藻进行饥饿预处理:取适量藻液以4 500 r/min的转速于常温条件下,离心20 min,去除上清液,用磷酸缓冲盐溶液将沉淀物洗出,重复3次.在无菌操作台上接入去除氮、磷的BG-11培养液,进行饥饿处理,共4天.最后将饥饿处理后的藻种接入不同氮磷梯度培养基中,初始接种密度是2*105 cells·mL-1,并放入25 ℃光照培养箱中,供给5 000 1ux的光照强度进行培养,光照和黑暗时间分别设为12 h:12 h,每天随机改变位置均匀照光,定时摇瓶三遍.
采用细胞计数分析仪(Cellometer R auto T4, Nexcelom, USA)、细胞计数板(Nexcelom Bioscience, Cellometer Auto T4 slide)进行藻细胞计数.用SPSS 20.0.0软件做数据的显著性分析.
采用热乙醇提取小球藻的叶绿素a,并用紫外可见吸收光谱法测量其含量[15].
培养基中硝酸盐的测定采用双波长检测法[16],并采用孔雀绿-磷钼杂多酸分光光度法测定磷含量(GB11894-89)[17].
本次实验采用调制叶绿素荧光仪(MAXI Imaging PAM,德国,WALZ)测量小球藻的叶绿素荧光参数[18],检测其光合作用变化.取2 mL微藻样品,在暗适应15分钟后测量光诱导荧光曲线.测定程序为:先以弱光照射测量初始荧光(Fo),然后进行饱和脉冲光(2 800 μmol·m-2·s-1)处理,以一个脉冲光为单位激发,随后关闭,产生最大荧光值(Fm),之后打开可以引起藻光合作用的作用光(75 μmol·m-2·s-1 ),待荧光稳定后再进行饱和脉冲光照射,一次脉冲结束后产生光化光获得的最大荧光(Fm').其他参数数值均是在选定模式下系统自动计算生成.Fv/Fm可以通过式(1)、(2)分别计算[7]:
ФPSII=Yield=(Fm'-F)/Fm'=ΔF/Fm'(1)
Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm(2)
式中:Fv为可变荧光,ФPSII和Yield均为作用光存在时PSII实际的光化学量子产量.
固定磷浓度P=0.2、0.4 mg/L,不同氮浓度条件下,实验组的AD值差异较小(P>0.05),而P=0.5、1 mg/L条件下,AD值差异显著(P<0.05).由此可知实验磷浓度条件下,P≤0.4 mg/L为小球藻增长的限制因素.
不同营养条件对小球藻的AD值影响如图1所示.由图可知,磷浓度从0.2增至0.4 mg/L时,AD值均随之增大,最终AD值约从4.30*106~5.20*106 cells·mL-1增至4.20*106~7.10*106 cells·mL-1.当P>0.4 mg/L时,各组最终AD值约为3.0*106~7.4*106 cells·mL-1,由此可知P<0.4 mg/L时,提高磷浓度能促进小球藻的生长; P>0.4 mg/L时,提高磷浓度对小球藻增殖的促进效果不显著.所以在试验氮磷营养浓度下,P=0.4 mg/L时最适宜小球藻生长.杨坤等[19]研究得出在0.47 mg/L磷浓度条件下,小球藻藻密度达到最大.这与本研究结论一致.同时研究结果表明:P<0.4 mg/L时,氮浓度与AD值的相关性不显著,且较高浓度的氮供给对小球藻繁殖有抑制作用,可能是因为P<0.4 mg/L时,磷元素为主要限制因子,会阻碍小球藻增长; 而当P>0.4 mg/L条件下,AD会随着氮浓度的增高而增大,导致不同氮浓度供应条件下的AD差异显著.
在不同初始氮磷浓度下,普通小球藻对N和P的吸收率见图2.根据图2(a)可知:在培养基中P<0.4 mg/L的条件下,外源磷浓度从0.2 mg/L增加到0.4 mg/L时,在N=1、2、3、6、8 mg/L情况下,小球藻对硝氮吸收率分别增加了21.5%、14.2%、9.4%、5.2%和4.6%,表明低磷条件下,磷浓度的增高有利于硝氮被吸收,提高磷浓度有助于小球藻吸收硝氮,表明此时氮吸收率只与初始磷浓度有关; 而当培养基中P>0.4 mg/L时,小球藻对硝态氮的吸收率同时受到N、P供给浓度的综合影响,且在N=2 mg/L时,氮的吸收率达到最大,为95.4%.此时若继续提高供给氮浓度,氮的吸收率会不升反降.同时,当氮浓度较低时(N≤3 mg/L),固定氮供给浓度,提高磷供给水平会促进氮的吸收率,接近100%.磷被消耗完后,氮的吸收速率会随之降低.
由图2(b)可知:初始供给磷浓度的不同致使各处理组达到100%磷去除率的时间不同.当P=1 mg/L时小球藻对磷的吸收利用集中在第5~7天,比磷吸收利用集中在前5天的其余低浓度处理组要晚一些.有研究表明,聚球藻(Synechococcus sp )在磷饥饿处理后的磷吸收速率比磷富足时快100倍[20],同本实验结果相近.P=0.2 mg/L的处理组中,氮浓度的增加会削弱小球藻吸收正磷酸盐的能力; P=0.4 mg/L处理组中在N=2 mg·L-1时小球藻对磷的吸收效果最好,继续提高氮浓度反会降低磷的吸收率; 而P>0.4 mg/L时,氮浓度的增加促进小球藻吸收正磷酸盐.这一结果也进一步证明了在P<0.4 mg/L时,磷是主要限制小球藻的增长的营养元素.
不同氮、磷浓度对小球藻的叶绿素a含量影响如图3所示,各实验组叶绿素浓度随时间基本呈现先增后降的趋势.四组不同磷浓度条件下小球藻的叶绿素浓度,在对数生长末期分别降低了55.05%~72.17%、0~41.25%、28.13%~49.55%、38.66%~64.95%.其中P=0.2 mg/L处理组在生长末期的叶绿素浓度最低,降幅最大.从图2(b)可以看出,P=0.2 mg/L处理组在实验初期培养基中的磷就被完全吸收,而由于没有外源营养供给,需要小球藻利用内部存储的氮、磷供细胞生长[21],且氮是组成叶绿素的主要元素之一,因此会引起叶绿素a的变化.而当P=0.4,0.5和1 mg/L时,氮供给充足时(N≥6 mg/L),磷会在对数末期被完全吸收,该条件下叶绿素a增长较稳定; 而N<6 mg/L条件下,叶绿素的合成会因营养供给不足而受阻,同样地,此时藻细胞会利用自身储存的叶绿素作为氮源进行生长,从而致使叶绿素a浓度降低,说明低磷条件下,叶绿素a会随着氮浓度的增加而增加; 但P<0.2 mg/L时,小球藻色素的合成会收到抑制.
不同初始氮磷浓度对普通小球藻光合作用效率的影响如图4,各实验组叶绿素荧光值Fv/Fm均随培养时间先增加后降低.其中,P=0.2 mg/L,处理组的Fv/Fm降幅最大,并在培养第6天达到0.52~0.57,随后开始在第7天迅速大幅度降低至0.21~0.28,至实验结束后该值稳定在0.18~0.24,较峰值降低了58%~63%,充分证明该实验组进入磷胁迫状态,藻细胞的光合作用能力受到影响[6].另外,如图1(a)和图3(a)所示,P=0.2 mg/L实验组AD值和叶绿素a浓度从第8天分别开始停止增长和明显降低,表明这一时期藻类的细胞分裂及色素合成均受到了抑制.根据上述结果,Fv/Fm对磷浓度变化的敏感度要高于AD
图4 不同营养条件下普通小球藻叶绿素荧光参数Fv/Fm的变化情况
Fig.4 Trend of chlorophyll fluorescence parameter Fv/Fm of C. vulgaris with different nutrient concentration
本实验培养营养条件下(NO3-N: 1~8 mg/L; PO43-P: 0.2~1.0 mg/L),小球藻的生长以及藻密度变化主要受到磷浓度变化的影响,并在P=0.4 mg/L时其生长状态最佳; 其最终生物量维持在3*106-7*106 cells·mL-1.P<0.4 mg/L的条件下,磷浓度的增高有利于硝态氮被吸收,氮浓度变化对于小球藻生长影响不显著.而当P>0.4 mg/L时,小球藻生长同时受到氮和磷浓度的影响,外源氮和磷供给水平越高越利于小球藻对磷和氮的吸收.此外,在低磷环境中,氮浓度增高可促进小球藻叶绿素a的积累,但过低的磷浓度(P=0.2 mg/L)会抑制叶绿素a的合成.实验结果表明,普通小球藻发生磷胁迫时的Fv/Fm阈值为0.18~0.24,其余实验条件均为磷限制.低磷浓度下,Fv/Fm与小球藻的AD值、营养盐变化及叶绿素a含量的相关性高,且对营养条件的变化更为敏感,因此Fv/Fm值用来研究营养盐对微藻的胁迫作用,具有较高的可靠性.